Proteomica

Questa è la domanda che riceviamo più spesso e forse la più difficile a cui rispondere. Teoricamente la spettrometria di massa è in grado di identificare a livello di zeptomoli ma la risposta corretta è che dipende dal campione e dalla domanda biologica a cui si vuole rispondere. Se vuoi identificare una singola proteina da gel, la quantità minima è una banda faint colorata con comassie colloidale (nell’ordine di 10-20ng). In generale, cerca di spedirci il maggior quantitativo possibile. Possiamo processare anche gel colorati con Silver staining se è il massimo quantitativo che puoi ottenere. Per l’identificazione di proteine da miscele complesse (ad esempio separate in una lane di gel) il quantitativo minimo sono da 10 μg a salire.
Per la determinazione del peso molecolare di proteine intatte dovresti inviarci almeno 100 μl ad una concentrazione minima di 10 pmol/μl. In genere questo è sufficiente per avere la determinazione del peso molecolare in condizioni denaturanti.

Siamo in grado di ottenere un’identificazione inequivocabile di una o più proteine contenute in un campione se sappiamo la specie di origine e alcuni dettagli sulla preparazione del campione (qualunque PTM nota, modifiche nella sequenza, se il gel proviene da una 2D o da un SDS-page, se il campione è stato alchilato artificialmente etc...)

I gel possono essere inviati in un foglio di plastica sigillato, se invece si tratta di bande provenienti da gel è ottimo se si trovano in un’eppendorf (una per banda). Non c’è bisogno di spedirli in ghiaccio. Per la determinazione del peso molecolare la composizione del buffer non è troppo critica ma non deve contenere detergenti o superare il 5% di glicerolo.

Paolo Soffientini e Angela Cattaneo
Cogentech S.c.a.r.l. c/o IFOM
Proteomics/MS facility
Via Adamello 16
20139 Milan, Italy

Noi non sequenziamo proteine, le identifichiamo. L’identificazione attraverso la spettrometria di massa è probabilistica, cioè si basa sul miglior match tra lo spettro teorico contenuto in un database e quello empirico misurato. Il punteggio assegnato a questo match e quindi la probabilità che sia corretto dipende da un numero di parametri come la qualità dello spettro, l’accuratezza della massa, la dimensione del database e l’algoritmo utilizzato per la ricerca. In più, maggiore è il numero di peptidi assegnato ad una proteina, maggiore sarà il punteggio. Una proteina è considerata identificata se il software può assegnare correttamente almeno 2 peptidi a questa proteina.

Dato che l’identificazione avviene per match con proteine presenti in un database, per principio se questa porteina non è presente nel database, non possiamo identificarla. Ma ci sono eccezioni: contattateci per avere informazioni a riguardo.

Siamo in grado di farlo. Ma la rilevazione e la localizzazione dei siti di modificazione non è mai immediata. Innanzitutto la fosforizlazione è sub-stechiometrica, cioè il peptide fosforilato è spesso poco abbondante e può essere mascherato dai peptidi non fosforilati della stessa proteina così come di altre. Secondo, la ionizzazione dei peptidi fosforilati è meno efficiente di quelli non modificati e questo non aiuta nella loro identificazione. Terzo, la frammentazione dei peptidi fosforilati non segue le stesse regole di frammentazione che si applicano agli altri peptidi e questo spesso rende gli spettri di difficile interpretazione. Infine il sito di fosforilazione potrebbe essere presente su un peptide troppo lungo o troppo corto per essere identificato e frammentato efficentemente. Se conoscete la sequenza della proteina e il sito su cui è prevista la modifica, la scelta di una proteasi diversa dalla tripsina potrebbe essere una buona alternativa per mappare il dominio desiderato. Possiamo inoltre arricchire i fosfopeptidi attraverso microcolonne di TiO2 in particolare per campioni complessi, ma tutte le criticità evidenziate in precedenza comunque permangono.

Noi identifichiamo alcune PTM (acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, siti di glicosilazione ed altre). È di aiuto se ci fornite indicazioni su quali possibili modifiche vi aspettate così possiamo inserirle nella ricerca. Contattateci per avere informazioni a riguardo.

Tagliando una banda da gel non è raro che questa contenga più proteine aventi lo stesso peso molecolare, alcune delle quali possono essere sotto il limite di rivelazione della colorazione utilizzata. La spettrometria di massa è di gran lunga più sensibile rispetto alle colorazioni coomassie o silver. Un’altra ragione per cui più proteine sono presenti in una banda è perchè le proteine più abbondanti possono essere diffuse su tutta la lane oppure essere degradate e di conseguenza è comune trovare proteine aventi peso molecolare diverso all’interno della tua banda.

Molto probabilmente sono state inserite nel campione durante la sua preparazione o nel caso in cui si stia analizzando un gel, durante la colorazione o il taglio delle bande. La polvere è una delle fonti maggiori di contaminazione, quindi assicurati che stai lavorando in una zona pulita. Possiamo offrirvi una lista di consigli per ridurre le contaminazioni.

Per la maggior parte degli utilizzatori una lista excell di proteine identificate è sufficiente, con un accession number relativo al database appropriato (ad esempio Uniprot). Ma possiamo offrire molto di più, come la sequenza dei peptidi identificati, il loro punteggio, la copertura di sequenza della proteina, gli spettri annotati ecc..cioè tutto quello che potrebbe essere richiesto per una pubblicazione, anche nel caso di modifiche post-traduzionali. Tutto questo si trova nel file Scaffold che vi invieremo come risultato. Inoltre possiamo dare indicazioni dettagliate sulla quantifica di proteine e peptidi, utilizzando sia tecniche di analisi senza marcatura che con marcatura utilizzando isotopi stabili (SILAC).

Per l’identificazione proteica e le analisi PTM riceverete un file Scaffold che raccoglie la maggior parte delle informazioni. Siamo felici di insegnarvi ad uilizzarlo. Per la quantificazione proteica attraverso Max Quant (Silac e Label Free) riceverete un file excel con evidenziate le proteine significativamente up/down regolate, tutte le proteine quantificate e una rappresentazione tramite Volcano plot o Christmas three dei risultati. Per le analisi Target riceverete un file excell con la quantificazione dei peptidi o proteine. Riceverete inoltre una mail dettagliata con un riassunto dei risultati e un power point per spiegare graficamente i risultati ottenuti. Contattateci per avere informazioni a riguardo.

Cerchiamo di inviare i risultati in una settimana da quando riceviamo i campioni per quanto riguarda l’identificazione delle proteine e massimo 3 settimane per espeirmenti di quantificazione e analisi PTM.

Contattaci per un’offerta dato che i costi variano molto in base alla tipologia di progetto, strumento utilizzato e quantità di analisi richieste.

Ci sono rarissimi casi in cui questo può succedere. Ci dispiace! Inoltre, per poter garantire l’alto livello dei servizi offerti è essenziale che l’utilizzo degli strumenti sia limitato ad utilizzatori esperti.