Cosa offriamo

L'unità di Proteomica e Spettrometria di Massa fornisce una struttura completa per l'identificazione e caratterizzazione proteica, comprendente varie piattaforme per la separazione di proteine e peptidi e tecniche all'avanguardia di MS e LC-MS/MS.

Servizio

Le nostre attività possono essere suddivise in:

  • Servizi di Spettrometria di Massa
  • Servizi di Proteomica
  • Analisi dei dati
Tutti i servizi includono la consulenza scientifica da parte dello staff dell'unità, l'assistenza pre e post analisi, l'interpretazione dei dati e un report esplicativo dei risultati ottenuti.

Innovazione

Aggiorniamo costantemente i nostri protocolli, softwares e tecnologie per assicurare l'alta qualità del nostro lavoro. Ottimizziamo costantemente i protocolli maggiormente utilizzati in proteomica e sviluppiamo nostre metodiche, rendendole poi disponibili per collaborazioni con ricercatori e clienti.

Qualità

La nostra facility lavora in accordo con le linee guida riconosciute dalla comunità scientifica per l'accertamento della qualità dei dati di proteomica, come:
"Universal Metrics for Quality Assessment of Protein Identifications"
"Recommendations for Mass Spectrometry Data Quality Metrics for Open Access Data".

Servizi

Spettrometria
di Massa

Mass Spectrometry
  • Determinazione del peso molecolare di proteine intatte attraverso techniche MS ESI e MALDI.
  • Determinazione dell'N- e C- terminale delle proteine e prodotti di proteolisi limitata tramite peptide mass fingerprinting e MS/MS.
  • Caratterizzazione di peptidi via MALDI e MALDI-TOF/TOF.

Proteomica

Proteomics
  • Identificazione di proteine da gel e in soluzione
  • Analisi Target (PRM)
  • Quantificazione senza marcatura (Label Free)
  • Quantificazione proteica tramite marcatura con isotopi stabili (SILAC)
  • Identificazione di modifiche post traduzionali
  • Arricchimento di fosfo peptidi (TiO2 e IMAC)
  • Separazione multi-dimensionale (isoelettrofocusing e cromatografia liquida)
  • Analisi comparativa di campioni semplici e complessi (IP, lisati cellulari, secretomi, organelli isolati).

Analisi dei dati

Data Analysis
    Il report dei risultati fornito e l'interpretazione dei dati sono effettuate con i più recenti softwares proteomici:
  • Mascot, Sequest e Andromeda per l'identificazione di proteine e la validazione di modifiche post-traduzionali
  • Proteome Discover 1.4
  • Skyline per la quantificazione di proteine target
  • MaxQuant-Perseus per l'identificazione e la quantificazione e analisi statistica
  • Programmi open source (BioGrid, String, Enrich-R) per l'analisi funzionale

Per maggiori informazioni tecniche riguardo il servizio di Proteomica

FAQ

Di seguito una lista delle domande più frequenti:

Questa è la domanda che riceviamo più spesso e forse la più difficile a cui rispondere. Teoricamente la spettrometria di massa è in grado di identificare a livello di zeptomoli ma la risposta corretta è che dipende dal campione e dalla domanda biologica a cui si vuole rispondere. Se vuoi identificare una singola proteina da gel, la quantità minima è una banda faint colorata con comassie colloidale (nell’ordine di 10-20ng). In generale, cerca di spedirci il maggior quantitativo possibile. Possiamo processare anche gel colorati con Silver staining se è il massimo quantitativo che puoi ottenere. Per l’identificazione di proteine da miscele complesse (ad esempio separate in una lane di gel) il quantitativo minimo sono da 10 μg a salire.
Per la determinazione del peso molecolare di proteine intatte dovresti inviarci almeno 100 μl ad una concentrazione minima di 10 pmol/μl. In genere questo è sufficiente per avere la determinazione del peso molecolare in condizioni denaturanti.

Siamo in grado di ottenere un’identificazione inequivocabile di una o più proteine contenute in un campione se sappiamo la specie di origine e alcuni dettagli sulla preparazione del campione (qualunque PTM nota, modifiche nella sequenza, se il gel proviene da una 2D o da un SDS-page, se il campione è stato alchilato artificialmente etc...)

I gel possono essere inviati in un foglio di plastica sigillato, se invece si tratta di bande provenienti da gel è ottimo se si trovano in un’eppendorf (una per banda). Non c’è bisogno di spedirli in ghiaccio. Per la determinazione del peso molecolare la composizione del buffer non è troppo critica ma non deve contenere detergenti o superare il 5% di glicerolo.

Paolo Soffientini e Angela Cattaneo
Cogentech S.c.a.r.l. c/o IFOM
Proteomics/MS facility
Via Adamello 16
20139 Milan, Italy

Noi non sequenziamo proteine, le identifichiamo. L’identificazione attraverso la spettrometria di massa è probabilistica, cioè si basa sul miglior match tra lo spettro teorico contenuto in un database e quello empirico misurato. Il punteggio assegnato a questo match e quindi la probabilità che sia corretto dipende da un numero di parametri come la qualità dello spettro, l’accuratezza della massa, la dimensione del database e l’algoritmo utilizzato per la ricerca. In più, maggiore è il numero di peptidi assegnato ad una proteina, maggiore sarà il punteggio. Una proteina è considerata identificata se il software può assegnare correttamente almeno 2 peptidi a questa proteina.

Dato che l’identificazione avviene per match con proteine presenti in un database, per principio se questa porteina non è presente nel database, non possiamo identificarla. Ma ci sono eccezioni: contattateci per avere informazioni a riguardo.

Siamo in grado di farlo. Ma la rilevazione e la localizzazione dei siti di modificazione non è mai immediata. Innanzitutto la fosforizlazione è sub-stechiometrica, cioè il peptide fosforilato è spesso poco abbondante e può essere mascherato dai peptidi non fosforilati della stessa proteina così come di altre. Secondo, la ionizzazione dei peptidi fosforilati è meno efficiente di quelli non modificati e questo non aiuta nella loro identificazione. Terzo, la frammentazione dei peptidi fosforilati non segue le stesse regole di frammentazione che si applicano agli altri peptidi e questo spesso rende gli spettri di difficile interpretazione. Infine il sito di fosforilazione potrebbe essere presente su un peptide troppo lungo o troppo corto per essere identificato e frammentato efficentemente. Se conoscete la sequenza della proteina e il sito su cui è prevista la modifica, la scelta di una proteasi diversa dalla tripsina potrebbe essere una buona alternativa per mappare il dominio desiderato. Possiamo inoltre arricchire i fosfopeptidi attraverso microcolonne di TiO2 in particolare per campioni complessi, ma tutte le criticità evidenziate in precedenza comunque permangono.

Noi identifichiamo alcune PTM (acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, siti di glicosilazione ed altre). È di aiuto se ci fornite indicazioni su quali possibili modifiche vi aspettate così possiamo inserirle nella ricerca. Contattateci per avere informazioni a riguardo.

Tagliando una banda da gel non è raro che questa contenga più proteine aventi lo stesso peso molecolare, alcune delle quali possono essere sotto il limite di rivelazione della colorazione utilizzata. La spettrometria di massa è di gran lunga più sensibile rispetto alle colorazioni coomassie o silver. Un’altra ragione per cui più proteine sono presenti in una banda è perchè le proteine più abbondanti possono essere diffuse su tutta la lane oppure essere degradate e di conseguenza è comune trovare proteine aventi peso molecolare diverso all’interno della tua banda.

Molto probabilmente sono state inserite nel campione durante la sua preparazione o nel caso in cui si stia analizzando un gel, durante la colorazione o il taglio delle bande. La polvere è una delle fonti maggiori di contaminazione, quindi assicurati che stai lavorando in una zona pulita. Possiamo offrirvi una lista di consigli per ridurre le contaminazioni.

Per la maggior parte degli utilizzatori una lista excell di proteine identificate è sufficiente, con un accession number relativo al database appropriato (ad esempio Uniprot). Ma possiamo offrire molto di più, come la sequenza dei peptidi identificati, il loro punteggio, la copertura di sequenza della proteina, gli spettri annotati ecc..cioè tutto quello che potrebbe essere richiesto per una pubblicazione, anche nel caso di modifiche post-traduzionali. Tutto questo si trova nel file Scaffold che vi invieremo come risultato. Inoltre possiamo dare indicazioni dettagliate sulla quantifica di proteine e peptidi, utilizzando sia tecniche di analisi senza marcatura che con marcatura utilizzando isotopi stabili (SILAC).

Per l’identificazione proteica e le analisi PTM riceverete un file Scaffold che raccoglie la maggior parte delle informazioni. Siamo felici di insegnarvi ad uilizzarlo. Per la quantificazione proteica attraverso Max Quant (Silac e Label Free) riceverete un file excel con evidenziate le proteine significativamente up/down regolate, tutte le proteine quantificate e una rappresentazione tramite Volcano plot o Christmas three dei risultati. Per le analisi Target riceverete un file excell con la quantificazione dei peptidi o proteine. Riceverete inoltre una mail dettagliata con un riassunto dei risultati e un power point per spiegare graficamente i risultati ottenuti. Contattateci per avere informazioni a riguardo.

Cerchiamo di inviare i risultati in una settimana da quando riceviamo i campioni per quanto riguarda l’identificazione delle proteine e massimo 3 settimane per espeirmenti di quantificazione e analisi PTM.

Contattaci per un’offerta dato che i costi variano molto in base alla tipologia di progetto, strumento utilizzato e quantità di analisi richieste.

Ci sono rarissimi casi in cui questo può succedere. Ci dispiace! Inoltre, per poter garantire l’alto livello dei servizi offerti è essenziale che l’utilizzo degli strumenti sia limitato ad utilizzatori esperti.

Staff e Contatti

Paolo Soffientini

Paolo Soffientini

Paolo si è laureato in Biotecnologie Agrarie Vegetali presso l'Università di Milano nel 2001. Ha lavorato in microbiologia, biochimica e trafficking di proteine (CNR, Milano) e in immunoterapia associata ai tumori (INT, Milano e USD, Ca) prima di entrare nella Facility di Proteomica e Spettrometria di Massa di Cogentech nel 2006.

Angela Cattaneo

Angela Cattaneo

Angela Cattaneo si è diplomata come Tecnico dell'Industria Chimica e ha acquisito esperienza decennale come tecnico di laboratorio prima nei laboratori R&D di Gruppo Zambon S.pA (Milano) e poi nel laboratorio di Spettrometria di Massa e Proteomica al DIBIT, Ospedale San Raffaele (Milano). Dal 2013 lavora nella Facility di Proteomica e Spettrometria di Massa di IFOM.

Contacts

  • Tel
    +39 02 574303706
    +39 02 574303705 (lab)
  • Email
    masspectrometry-service [@] cogentech.it