Proteomica & Metabolomica

La spettrometria di massa è una tecnica analitica molto sensibile (in grado di identificare proteine a livello di zeptomoli), tuttavia la quantità minima richiesta dipende sia dal campione che dalla domanda biologica a cui si vuole rispondere.

• Per l’identificazione di una singola proteina da gel la quantità minima richiesta corrisponde a una banda faint colorata con Coomassie colloidale (nell’ordine di 10-20 ng).
  Possiamo processare anche gel colorati con Silver staining se è il massimo quantitativo che è possibile ottenere.
• Per l’identificazione di proteine da miscele complesse (ad esempio separate in una lane di gel) il quantitativo minimo è circa 10 μg.
• Per la determinazione del peso molecolare di proteine intatte sono necessari almeno 100 μl ad una concentrazione minima di 10 pmol/μl (in genere questo è sufficiente per avere la determinazione del peso molecolare in condizioni denaturanti).
• Per l’analisi del proteoma globale da digestione in-soluzione sono richiesti almeno 25 ug di proteine.
• Per la determinazione di modifiche post-trasduzionali sono richieste quantità maggiori.

Siamo in grado di ottenere un’identificazione inequivocabile di una o più proteine contenute in campioni biologici conoscendo la specie di origine e i dettagli sulla preparazione del campione (PTMs note, modifiche nella sequenza amminoacidica, 1D/2D SDS-PAGE gel, buffer di solubilizzazione proteica, alchilazione artificiale delle proteine...).

I gel possono essere inviati a temperatura ambiente all’interno di un contenitore sigillato per mantenerne l’idratazione; le bande di gel o i campioni in soluzione possono essere posti in provette tipo eppendorf ed inviati in ghiaccio secco. La composizione del buffer di lisi dei campioni dipende dalla solubilità delle proteine di interesse. Si suggerisce, quando possibile, di effettuare la lisi cellulare in un buffer “massa compatibile” come urea buffer, al fine di poter procedere alla digestione in-soluzione ed ottenere un maggior peptide recovery.
Nel caso in cui nel buffer di estrazione delle proteine siano contenuti componenti che possono interferire con l’analisi MS, come detergenti (es. SDS, Triton, NP40, Zwittergent, CHAPS,…), i campioni vanno caricati su gel SDS-Page e noi procederemo alla digestione enzimatica in gel; i campioni in soluzione possono essere processati con i metodi FASP o SP3.
Per la determinazione del peso molecolare la composizione del buffer non è troppo critica ma non deve contenere detergenti; i campioni devono essere purificati con StageTip C4 prima dell’analisi MS.

Angela Cattaneo e Giorgia Parodi
Cogentech c/o IFOM
Proteomics/MS facility
Via Adamello 16
20139 Milan, Italy

Noi non sequenziamo proteine, le identifichiamo. L’identificazione, attraverso la spettrometria di massa, è probabilistica, cioè si basa sul miglior match tra lo spettro teorico contenuto in un database e quello empirico misurato. Il punteggio assegnato a questo match, e quindi la probabilità che sia corretto, dipende da un numero di parametri come la qualità dello spettro, l’accuratezza della massa, la dimensione del database e l’algoritmo utilizzato per la ricerca. In più, maggiore è il numero di peptidi assegnato ad una proteina, maggiore sarà il punteggio. Una proteina è considerata identificata se il software può assegnare correttamente almeno 2 peptidi a questa proteina.

L’identificazione di una proteina avviene per match con proteine presenti in uno specifico database, per cui se non si conosce la sequenza della proteina da poter inserire nel database, non è possibile identificarla.

Siamo in grado di identificare alcune PTMs, tra cui acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione e siti di glicosilazione, purché si conosca la specifica modifica, al fine di poterla inserire nella ricerca con l’opportuno software di data-analysis. Se conoscete la sequenza della proteina e il sito su cui è prevista la modifica, la scelta di una proteasi diversa dalla tripsina potrebbe essere una buona alternativa per mappare il dominio desiderato.

Siamo in grado di identificare alcune PTMs, tra cui acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione e siti di glicosilazione, purché si conosca la specifica modifica, al fine di poterla inserire nella ricerca con l’opportuno software di data-analysis. Se conoscete la sequenza della proteina e il sito su cui è prevista la modifica, la scelta di una proteasi diversa dalla tripsina potrebbe essere una buona alternativa per mappare il dominio desiderato.

Una banda da gel non è raro che contenga più proteine con lo stesso peso molecolare, alcune delle quali possono essere sotto il limite di rivelazione della colorazione utilizzata. La spettrometria di massa è di gran lunga più sensibile rispetto alle colorazioni coomassie o silver. Un’altra ragione per cui più proteine sono presenti in una banda è perchè le proteine più abbondanti possono essere diffuse su tutta la lane oppure essere degradate e di conseguenza è comune trovare proteine aventi peso molecolare diverso all’interno della stessa banda.

È probabile che siano state inserite nel campione durante la sua preparazione o nel caso in cui si stia analizzando un gel, durante la colorazione o il taglio delle bande. La polvere è una delle fonti maggiori di contaminazione, quindi è bene assicurarsi di lavorare in una zona pulita e utilizzare soluzioni preparare fresche e filtrate.

Per l’identificazione proteica e le analisi di PTMs riceverete un file .sf3 di Scaffold con le informazioni dei peptidi assegnati ad ogni proteina, lo score, il sequence coverage e gli spettri annotati di ogni peptide identificato. Per l’identificazione e quantificazione relativa Label Free o SILAC riceverete un file excel con la tabella delle proteine identificate e i valori di intensità che verranno normalizzati e sottoposti a test statistici; dall’analisi statistica riceverete la lista delle proteine statisticamente significative e i dati ottenuti verranno rappresentati graficamente.
Riceverete inoltre una mail dettagliata con un riassunto dei risultati e spiegazioni di tabelle e grafici.

Dipende dal servizio richiesto e dal numero di campioni; solitamente i risultati vengono consegnati entro due-tre settimane dal ricevimento dei campioni.

Si consiglia di contattarci per richiedere un’offerta perché i costi variano in base alla tipologia di esperimento, strumento utilizzato e numero di campioni.

Solitamente preferiamo analizzare pellets o estratti a partire da almeno 1x10⁶ cellule

È preferibile partire da una quantità pari a 20-30mg

È necessario conosce il tipo di campione da analizzare (cellule, tessuti ecc) cosi da poter ottimizzare i protocolli di analisi.

I campioni dovranno essere spediti in ghiaccio secco. I campioni per lipidomica possono essere spediti come pellet secchi mentre per metabolomica sarebbe meglio spedire l’estratto.

Per conoscere i prezzi dei nostri servizi vi invitiamo a contattarci per mail. I costi cambiano in base al tipo di analisi e al numero di campioni.

La facility si impegna a consegnare I risultati in 3 settimane (massimo) dalla ricezione del campione.

Se sono richiesti metaboliti o lipidi specifici sarebbe meglio saperli prima di procedere con l’analisi di modo da scegliere e ottimizzare l’analisi per questi.

Per esperimenti di metabolomica è importante conoscere il numero di cellule/mg di tessuto di partenza e possibilmente anche il contenuto totale di proteine. Queste informazioni potranno poi essere utilizzare per normalizzare i dati finali.